乳酸菌粉冻干性能影响因素探讨

乳酸菌作为益生菌种类之一，其益生功效被广泛应用于保健食品、医药和食品等行业中。

其生产工艺中真空冷冻干燥是其制备工艺中的主要环节之一，其乳酸菌的抗冻性直接影响冻干粉活菌数水平，其冷冻干燥工艺，甚至前期的高密度乳酸菌发酵工艺条件都会影响乳酸菌的抗冷冻性，而发酵工艺条件对乳酸菌的抗冷冻性的影响很容易被研究学者所忽视。不同种类的乳酸菌，其抗冻能力大小不尽相同，但是其抗冻过程中的相关机理基本是一致的。本文从发酵工艺过程中的相关因素（培养基组分、培养温度、pH、保护剂、冻干工艺）对乳酸菌抗冻性的影响原理进行说明，为提高乳酸菌的抗冻性，进而提高其冻干粉活菌数水平提供参考。

一、培养基中的碳源、氮源等成份对其抗冷冻性的影响。

培养基的组分中碳氮源是主要的影响因素，它们可以对菌体细胞膜中不饱和脂肪酸的含量产生影响，选择合适的碳源，可以增加细胞膜中不饱和脂肪酸的含量，而其含量的多少与细胞膜的流动性成正比，因此可以提高菌体细胞膜的流动性，使菌体呈现不同程度的抗冻性，使菌体在冻干后的活菌数得到很大提高。培养基中的碳氮源除了会影响乳酸菌细膜中的不饱和脂肪酸含量外，不同种类的氮源及碳源还会使乳酸菌的形态发生改变，改变其菌体对周围环境的抗性。有研究表明动物来源的氮源可提升菌体的抗冻性，采用合适的氮源、碳源可使菌体产生可保护菌体的抗冻代谢产物，添加海藻糖，需要考虑其被代谢后产酸对菌体的影响，因此其添加量一定要控制的合理范围内。培养基中添加钙离子、吐温-80，可增加细胞中的不饱和脂肪酸，增强细胞膜的流动性，进而提高其抗冷冻能力。在乳酸菌的培养基营养成份改变过程中，以发酵液活菌数作为最基本的参考指标，同时更重要的是要考虑在该种培养基下培养得到的乳酸菌对其在后期真空冷冻干燥过程中抗冻性的影响，以得到一个即经济又实用的培养基配方。

 二、生长温度、pH、收获时间对其抗冻性的影响

研究表明大多数乳酸菌在低于最适温度3-5℃时，会提高菌体膜内不饱和脂肪酸 C_18:2 的含量，其细胞膜的流动性也相应增强，最终提高其抗冷冻能力，但需要把握好温度的变化，不能过低，否则不利于菌体生长。低温还会促进某些乳酸菌多糖合成，从而提高其冷冻干燥存活率。因此，适当降低培养温度，可改变膜内不饱和脂肪酸的含量，在冻干时有利于提高细胞膜的流动性；同时还能促进乳酸菌的多糖合成，提升乳酸菌的抗冻性。

研究发现不同的乳酸菌（球菌、杆菌等）其发酵pH值对抗冻性有明显区别，乳球菌在pH值为6.0的发酵培养条件下生长比较适合；而乳杆菌则适合在pH值为5.0的发酵培养条件下生长。主要原因还是不同pH值会增加细胞膜内不饱和脂肪酸的含量，提高菌体细胞膜的流动性，改变菌体形态，进而提高其抗冻性能；过酸过碱都不利于菌体的生长。因此，针对不同的乳酸菌需控制其相适应的发酵pH值，添加适当的酸碱中和剂（氢氧化钠、氨水等）维持恒定的pH值，在相应的发酵pH值条件下培养，可影响菌体膜内脂肪酸的含量，改变菌体形态，进而提升其菌体的抗冻能力。

不同的乳酸菌菌体收获期对其活菌数有显著影响。有研究发现菌体在发酵培养达到稳定期初期后经过离心、乳化、冻干收获得到的菌体存活率较对数期中期收获的菌体存活率高8倍。之所以在稳定期收获的菌体其抗冻性要优于对数期，是因为处在稳定期的菌株因为培养条件的改变（低物的累积、pH值的改变等）、营养物质的缺乏，使其菌体生长与死亡处于一种动态平衡状态，从而诱导菌体产生一系列适应环境的应激反应，提高了其对不良环境的抗性，如稳定期时其细胞膜脂类成分（环丙烷化脂肪酸（cycC_19∶0）含量增加）发生改变，从而增强乳酸菌的抗冷冻干燥能力。另外在稳定期时，其乳酸菌的应激蛋白的表达水平、细胞壁的结构上也发生了剧烈变化，导致其对冷冻干燥等不利条件的抗性增加。

 三、保护剂对乳酸菌的抗冷冻性的影响

冻干保护剂对乳酸菌的冻干存活率有着直接的影响，因此乳酸菌的菌泥在冻干前与适当的保护剂乳化混合后冻干，可提高乳酸菌的存活率。在冷冻干燥和保存中，不同的物质如糖类（蔗糖、乳糖和海藻糖）、蛋白质化合物（脱脂牛奶）已被作为保护剂来提高乳酸菌的存活率。从目前的研究看，对乳酸菌菌体的冻干脱水方面具有显著保护作用的是碳水化合物类保护剂。其作用机理在于抑制膜脂的相变，即在乳酸菌菌体在冻干升华干燥脱水时，进行“水置换”作用，使得在有碳水化合物保护剂存在的条件下，其干燥膜脂状态与未脱水前生理特征相似，从而稳定其菌体细胞结构，提高冻干后菌体的存活率；而各种保护剂搭配使用优于单独使用，需要将大分子和小分子物质结合起来使用，才能更好的发挥其保护效果。

四、冻干工艺对乳酸菌的抗冷冻性的影响

在冻干过程中，其冻干工艺也会影响菌体的冻干存活率。其中缓慢冷冻可以增加乳酸菌的抗冷冻性。原因是经过预冷处理的乳酸菌，其菌体受低温刺激，可诱导其产生冷应激蛋白，提高相关酶的低温活性；此外，低温会使菌体细胞膜上的饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转变，增加菌体在低温下细胞膜的流动性。这些现象对乳酸菌后期的冷冻干燥抗冻性起着重要的积极保护作用 ^[44]。另外, 也有研究表明冻干时，其冷冻速率在5−180°C/min之间时，冷冻干燥时胞内水分会完全渗出菌体外，菌体内不会出现结晶，乳酸菌存活率较高；当冷冻速率在180-5000°C/min之间时，菌体内的水分容易在外渗过程中形成结晶，进而容易对菌体造成机械损伤；当冷冻速率大于5000°C/min时，胞内水分来不及外渗而迅速形成结晶，细胞存活率会受一定的影响；因此在预冻时，需要根据不同菌体的特性来调整其冷速率，以达到最佳冷冻存活率。

真空冷冻干燥是乳酸杆菌菌粉制备工艺中的重要环节之一，菌体在冷刺激下会发生一系列改变，例如细胞膜的变化、遗传物质的变化等。从乳酸菌菌体自身来说，其抗冻性能取决于细胞膜的脂肪酸构成，同时与菌体的形态有一定的关联。即细胞膜中高含量的不饱和脂肪酸及环丙烷化脂肪酸有助于提高菌体的抗冷冻能力；对外在条件而言，处在稳定生长期的乳酸菌，其培养基营养成分的缺失，可诱导菌体产生相应适应环境的酶类，提高其抗冷冻干燥的能力；选择合适的碳源和氮源、添加适量的Ca^2＋以及吐温-80均可以增强菌株的抗冷冻干燥能力；对一些乳酸菌来说，在较低温度、pH值的条件下培养，也可以提高菌体的抗冷冻干燥能力；在冻干保护剂的选择应用时，可将大分子和小分子物质相结合使用，增强其冻干时保护剂菌体存活率的效果。冻干前对乳酸菌进行预冷处理，控制好预冷速率，均能有效提高其乳酸菌的存活率。影响乳酸菌的抗冻性的因素有很多，但是乳酸菌的抗冻性是一个很复杂的过程，仍需在今后对其进行更进一步深入的研究。

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