灵芝琼脂固体菌种超声均质效果及液体发酵研究

 

灵芝 (Lingzhi) 又称为瑞草、万年蕈、不老草、仙草、神芝，隶于属担子菌门、层菌纲、多孔菌目、灵芝科、灵芝属，在我国主要指赤芝 (Ganoderma lucidum)、紫芝 (Ganoderma sinense) 以及松杉灵芝 (Ganoderma tsugae) 等具有较高药用价值的灵芝，是我国、日本、韩国、泰国等东方国家的一种珍贵传统中药，主要用于肝炎、高血压、高血脂和胃癌等疾病的治疗。灵芝性温、味甘、微苦，有益心气、生血、助心安神、益肺气、坚筋骨、利关节、安神补肝等多种功能。常服用灵芝可延年益寿、增强体格[1]。

灵芝含有多糖、三萜、甾醇、生物碱、核酸、蛋白质以及微量元素等多种生物活性成分，其中灵芝多糖和三萜类物质是灵芝药效的关键物质基础[2, 3]。研究表明灵芝多糖具有抗肿瘤、免疫调节、提高肝脏解毒功能、抗衰老、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂等作用[4]；三萜类主要物质灵芝酸显示出抗肿瘤、抗艾滋病毒、抑制组织胺释放、降血压、抗菌等活性[3]。由于灵芝的药用价值，其高效生产技术成为灵芝研究的重要课题。

由于野生灵芝资源非常稀少，难以满足不断增长的市场需求，人工栽培是目前灵芝生产主要方法，但栽期周期长，且不同批次间活性成分组成以及含量存在较大差异，不利于灵芝标准化生产、应用和市场推广。灵芝液体深层发酵具有生产周期短、易于过程控制以及自动化程度高等优点，且研究表明发酵产物组分以及功能活性与子实体相近[5-9]，因此，以灵芝细胞、多糖、灵芝酸和总三萜为目标，研究人员对灵芝液体发酵开展了深入研究[10-14]。

食药用菌液体深层发酵离不开菌种制备，目前，灵芝以及其它食用菌液体发酵通常以平板培养菌种为发酵接种物[15, 16]或作为液体菌种种子培养后作为发酵种子[17, 18]。采用平板培养菌种作为发酵种子可减少菌种制备时间，但具有接种量要求大、发酵周期长、产率低以及菌丝量难以控制等缺点，菌种生长点过少是导致发酵周期长和产率低主要原因。为提高固体琼脂菌种生长点，本文研究灵芝超声破碎均质及其液体深层发酵性能，为灵芝液体发酵菌种制备及其发酵提供参考。

 

1. 材料与方法

 

1.1 主要仪器

JY-96 IIN超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股件有限公司；UV5800-PC紫外可见分光光度计，上海元析分析仪器有限公司；DHP-9272A电热恒温培养箱，上海飞越实验仪器有限公司；恒温摇床NRY-2102C，上海南荣实验室仪器有限公司；LEICA DM750光学显微镜，配制LEICA DMC2900相机。

 

1.2菌株

供试灵芝菌种CCMCC 5.535购于中科院微生物研究所，本实验室保存于PDA斜面。

 

1.3 培养基

PDA培养基：200 g去皮马铃薯、20 g葡萄糖、20 g琼脂、1000 mL水，121°C灭菌20 min。

发酵培养基 (每L)：葡萄糖 35 g，蛋白胨 4 g，酵母粉 4 g，K2HPO4 1.0 g， MgSO4 0.5 g，维生素B1 0.01g。

 

1.4 菌株活化及平板培养

菌株转至新配制PDA斜面，25°C培养7 d活化，活化菌株接至PDA平板培养7 d。

 

1.5 超声破碎

用灭过菌的打孔器（直径0.5 cm）于平板菌落近平缘打孔，挑取20个琼脂块至20 mL无菌水（50 mL离心管）。超声破碎前用75%酒精擦拭超声波细胞破碎仪变幅杆消毒、无菌水擦洗，超声破碎10 s共6次1 min，即1 mL超声悬液中的生物量等于1琼脂块。

 

1.6 显微观察

吸取50 μL超声破碎菌种于载玻片上，盖上载玻片，10倍目镜下观察拍照。

 

1.7 菌落计数

吸取200 μL超声破碎菌种至9 cm PDA平板，均匀涂布，25°C培养，5 d后观察计数。

 

1.8 发酵培养

 

1.8.1 摇床培养

吸取1 mL、2 mL、3 mL超声固体琼脂菌种至50 mL发酵培养基（150 mL摇瓶），接种3块固体琼脂菌种的作为对照。培养条件：30°C、160 rev/min培养10 d。

 

1.8.2 先静止后摇床培养

接种3 mL超声琼脂菌种至50 mL发酵培养基（150 mL摇瓶），30°C静置培养3 d，后7 d、30°C、160 rev/min培养；接种3块固体琼脂菌种的作为对照，其中一组全程摇床培养，10 d、30°C、160 rev/min，另一组发酵方法同超声琼脂菌种。

 

1.9 分析方法

 

1.9.1 生物量（干重法）

发酵液3000 ×g离心收集菌丝并去除琼脂块培养基，上清用于胞外多糖和残葡萄糖分析；菌丝用去离子水洗涤，离心收集，重复2次。菌丝70℃烘至恒重，计算生物量，并用于胞内多糖含量测定。

 

1.9.2 残葡萄糖

3.5-二硝基水杨酸法。

 

1.9.3 pH

数显pH计测定。

 

1.9.4 多糖

胞外多糖：吸取10 mL离心后的发酵液上清至透析膜 (分子截留量10000)， 流动自来水透析24 h去除葡萄糖等小分子物质，收集透析液向其加入40 mL 95%乙醇，充分振荡，4℃冰箱过夜。3000 ×g离心10 min弃上清，沉淀于25 mL 1 mol/L NaOH 60℃水浴 1 h，离心收集上清。

胞内多糖：干菌丝研碎，称取100 mg粉末状菌丝至25 mL1 mol/L NaOH 溶液，60℃水浴 1 h。3000 ×g离心10 min收集上清。上述两种上清中还原性糖测定采用苯酚-硫酸法测定[19]。

 

2. 结果与分析

 

2.1 超声破碎琼脂菌种的显微观察

图1为灵芝平板培养琼脂菌种超声破碎显微图片，可以看到灵芝菌丝体大小较均一以及少数短菌丝片段（有一些视野有较大菌丝体），此外，视野中看不到培养基的粒状物，可见超声是一种固体琼脂菌种有效的均质方法，可均质化菌丝体以及完全均质琼脂培养基。

 

 

图1 灵芝琼脂菌种超声均质显微图片

Figure 1 Micrographs of ultrasonic Ganoderma lucidum mycelia in PDA medium

 

2.2 固体琼脂菌种超声均质菌落计数

图2为固体灵芝琼脂菌种超声均质悬液涂布平板菌落图， 图A显示菌落大小相近，同时也发现有成片菌落存在（图B），由此说明固体琼脂菌种超声均质处理后仍部分较大菌丝体存在，与镜检结果吻合。菌活计数显示每1琼脂块经超声处理后可形成约186个菌落。须指出的是本实验培养时间下极可能有相当数量小菌丝片段尚未生长成可肉眼观察的菌落，因此，超声波破碎是固体灵芝琼脂菌种有效的均质方法，产生大量新的生长点。

 

 

图2 超声处理均质灵芝平板菌种涂布平板培养

Figure 2 Colonies of ultrasonic Ganoderma lucidum mycelia after grown on Petri dish

 

2.3摇床发酵

表1为固体琼脂菌种经超声波破碎均质处理以及未经超声波均质处理作为接种物的发酵结果。表中可以看出超声均质菌种发酵终点生物量、胞内以及外多糖含量低于未超声均质处理的琼脂块菌种；从残葡萄糖分析，超声均质菌种葡萄糖利用较少，显示发酵不充分，这与其低生物量和胞内胞外多糖相吻合。显然菌种均质化处理提供了接种物更多生长点，但发酵效率未见提高，这可能与均质菌丝摇床发酵过程聚集有关[20]。

 

表1 灵芝琼脂菌种和超声破碎为菌种的发酵比较

Table 1 Comparison of fermentation results with the mycelial agar disc and its ultrasonic mycelia suspension as inoculums in shake flasks

                                                    注：接种量为3个琼脂块或相同于其超声处理悬液；IPS, Intracellular polysaccharide; EPS, Exopolysaccharide。

 

2.4先静止后摇床发酵

表2为超声均质菌种以及平板培养琼脂块菌种先静止后摇床，以及平板培养琼脂块菌种恒摇床发酵结果。表中可以看出，3 mL超声波均质菌种发酵终点时生物量和胞外多糖均高于2 mL及1 mL均质菌种；与对照（3个平板琼脂块菌种先静止后摇床）相比，胞外多糖和生物量稍低，不过无统计意义上差异，但超声波均质菌种发酵过程中形成均一性菌丝球，这可作为研究发酵细胞生理的材料，同时适合作为种子用于扩大培养。

超声波均质菌种先静止培养后摇床发酵方法与以平板培养琼脂块作为菌种的恒摇床发酵相比，生物量、胞内多糖、胞外多糖均显著高于后者，结合表1结果可知先静止培养后摇床发酵是一种适合超声波均质菌种的发酵方法。

 

表2 灵芝琼脂菌种和超声破碎为菌种的发酵比较

Table 2 Fermentation results with the mycelial agar disc and its ultrasonic mycelia suspension as inoculums in shake flasks

                                                            a, 超声均质菌种；b，固体琼脂菌种; IPS, Intracellular polysaccharide; EPS, Exopolysaccharide。

 

3. 讨论

食药用菌液体深层发酵是一种具有潜在应用前景的生产食药用菌活性物质的方法，利用其生产灵芝菌丝、灵芝酸和多糖等活性成分有广泛深入的研究[10]，此外在虫草[21-22]多糖、虫草素和腺苷的生产以及樟芝[23]、灰树花[24]、银耳[25]、毛木耳[26]多糖生产上也有一定研究。与单细胞微生物相比食药用菌为一种丝状真菌，生长慢，液体培养时形成菌丝球，不利于液体发酵菌种制备。食药用菌液体发酵菌种的制备研究人员通常先将保藏菌种活化，（1）刮取活化菌种气生菌丝培养液体菌种[27-28]或平板培养制备菌丝悬液作为发酵菌种[29]，或切取菌苔发酵[21]；（2）活化菌种平板培养，取琼脂块用于液体发酵[15, 30]或培养液体菌种[17, 31]或再扩大培养作为发酵接种物。液体菌种使用前常采用均质机[32]或研磨[33]进行均质。本研究采用超声波破碎固体琼脂菌种，可有效均质化菌丝，作为接种物。图3为食药用菌液体菌种制备（包含本研究）方法。

 

 

 

图3 食药用菌液体深层发酵菌种制备方法

Figure 3 Current methods of inoculum preparation for submerged fermentation among edible and medicinal mushrooms

 

本研究利用超声波破碎法均质处理固体琼脂菌种，以其作为发酵接种物具有大量菌丝生长点，但摇床发酵时发酵过程中所形成的菌球数量偏少，发酵过程菌丝体聚集可能是引起这一现象的原因。Yang和Yang认为发酵罐转速影响菌丝聚集[20]，这可合理解释超声均质菌丝发酵水平未能提高的原因。为避免或减少发酵过程均质菌丝聚集，采用先静止培养减少菌丝聚集机会，再摇床增加溶氧促进生长，结果该发酵方法可形成均一性好且数量众多菌球，因此，可以认为菌丝体较大时摇床培养频繁接触已不易发生聚集。从发酵结果看，与以琼脂块菌种恒摇床培养相比，生物量和多糖得率远高于前者，主要原因为该发酵模式时减少和避免了菌丝聚集，结果生长点多，因此，先静止培养阶段是超声破碎琼脂菌种合适的发酵方法。本研究拓展了食药用菌液体发酵菌种制作和发酵方法，具有较好的参考价值。

 

参考文献

 

[1] Wachtel-Galor S, Tomlinson B, Benzie IF. Ganoderma lucidum (‘Lingzhi’), a Chinese medicinal mushroom: biomarker responses in a controlled human supplementation study[J]. British Journal of Nutrition, 2004, 91(2): 263-269.

[2] Paterson RR. Ganoderma-a therapeutic fungal biofactory[J]. Phytochemistry, 2006, 67(18): 1985-2001.

[3] Xu JW, Zhao W, Zhong JJ. Biotechnological production and application of ganoderic acids[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87(2): 457-466.

[4] Liu GQ, Zhao Y, Wang XL, et al. Biosynthesis and fermentation control of polysaccharides from Ganoderma lucidum[J]. Mycosystema, 2011，30(2): 198-205.

刘高强，赵艳，王晓玲，等. 灵芝多糖的生物合成和发酵调控[J]. 菌物学报，2011，30(2): 198-205.

[5] Liu GQ, Ding CY, Zhang KC, et al. Effects of medicinal insect Catharsius molossus on submerged fermentation and in vivo anti-hepatoma activity of Ganoderma lucidum[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2009，25(6): 880-886.

刘高强，丁重阳，章克昌，王晓玲. 药用昆虫蜣螂对灵芝发酵和抗小鼠肝癌活性的影响[J]. 生物工程学报，2009，25(6): 880-886.

[6] Baek S, Kim Y, Yong H, et al. Antitumor activities of the proteoglycans from the mycelium of Ganoderma lucidum IY009[J]. Yakhak Hoechi, 2001, 45(6): 641-649.

[7] Kimura Y, Taniguchi M, Baba K. Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: Mechanism of action and isolation of an active substance[J]. Anticancer Research, 2002, 22(6A): 3309-3318.

[8] Tang YJ, Zhong JJ. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid[J]. Enzyme Microbial Technology, 2002, 31(1-2): 20-28.

[9] Sone Y, Okuda R, Wada N, et al. Structures and antitumor activities of the polysaccharides isolated from fruiting body and the growing fermentation of mycelium of Ganoderma lucidum[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1985, 49: 2641-2653.

[10] Wagner R, Mitchell DA, Sassaki GL, et al. Current techniques for the cultivation of Ganoderma lucidum for the production of biomass, Ganoderic acid and polysaccharides[J]. Food Technology and Biotechnology, 2003, 41(4): 371-382.

[11] Xu P, Ding ZY, Qian Z, et al. Improved production of mycelial biomass and ganoderic acid by submerged culture of Ganoderma lucidum SB97 using complex media[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2008, 42(4): 325-331.

[12] Liu GQ, Ding CY, Zhang KC. Effects of powdered dung beetle (Catharsius molossus) on cell growth and triterpenoid production of Ganoderma lucidum[J]. Mycosystema, 2008, 27(5): 757-762.

刘高强，丁重阳，章克昌. 蜣螂对灵芝发酵菌丝体生长和三萜产物形成影响[J].菌物学报，2008, 27(5): 757-762.

[13] Gao XX, Yao Q, Wang L, et al. Effect of different fungal elicitors on production of polysaccharides and triterpenoid in liquid fermentation of Ganoderma lucidum[J]. Food Science, 2009，30(23): 309-313.

高兴喜，姚强，王磊，等. 真菌激发子对灵芝液体发酵生产多糖和三萜类物质的影响[J]. 食品科学，2009，30(23): 309-313.

[14] Yu SP, Zhang JS, Tang QJ, et al. Correlation between intracellular triterpenes from mycelia of Ganoderma lucidum in different growth stage and inhibition effect on tumor cells[J]. Mycosystema, 2004，23(4): 548-554.

余素萍，张劲松，唐庆九，等. 不同发酵阶段的灵芝菌丝三萜类成分与抗肿瘤作用相关性研究[J]. 菌物学报，2004，23(4): 548-554.

[15] 宋频然，常继东. 灵芝胞外多糖高产菌株筛选及其深层发酵培养基的优化[J]. 食用菌学报，2003, 10(2): 9-16.

[16] Yang FC, Ke YF, Kuo SS. Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake-flask cultures[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 27(3-5): 295-301.

[17] Yang FC, Yang MJ, Cheng SH. A novel method to enhance the mycelia production of Ganoderma lucidum in submerged cultures by polymer additives and agitation strategies[J]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 2009, 40(2): 148-154.

[18] Park JP, Kim SW, Hwang HJ. Stimulatory effect of plant oils on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 31(3): 250-255.

[19] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356.

[20] Yang FC, Yang MJ. Influence of agitation intensity on mycelium aggregation of Ganoderma lucidum[J]. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers, 2005, 36: 669

[21] Hsu TH, Shiao LH, Hsieh C, et al. A comparison of the chemical composition and bioactive ingredients of the Chinese medicinal mushroom DongChongXiaCao, its counterfeit and mimic, and fermented mycelium of Cordyceps sinensis[J]. Food Chemistry, 2002, 78(4): 463-469.

[22] Shih IL, Tsai KL, Hsieh C. Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris[J]. Biochemical Engineering Journal, 2007, 33(3): 193-201.

[23] Shih IL, Pan K, Hsieh C. Influence of nutritional components and oxygen supply on the mycelial growth and bioactive metabolites production in submerged culture of Antrodia cinnamomea[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(5): 1129-1135.

[24] Lee BC, Bae JT, Pyo HB, et al. Biological activities of the polysaccharides produced from submerged culture of the edible Basidiomycete Grifola frondosa[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 32(5): 574-581.

[25] Cho EJ, Oh JY, Chang HY, et al. Production of exopolysaccharides by submerged mycelial culture of a mushroom Tremella fuciformis[J]. Journal of Biotechnology, 2006, 127(1): 129-140.

[26] Xu CP, Yun JW. Optimization of submerged-culture conditions for mycelial growth and exo-biopolymer production by Auricularia polytricha (wood ears fungus) using the methods of uniform design and regression analysis[J]. Biotechnology Applied and Biochemistry, 2003, 38(Pt 2): 193-199.

[27] Fang QH, Zhong JJ. Effect of initial pH on production of ganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum[J]. Process Biochemistry, 2002, 37(7): 769-774.

[28] Zhu LW, Zhong JJ, Tang YJ. Significance of fungal elicitors on the production of ganoderic acid and Ganoderma polysaccharides by the submerged culture of medicinal mushroom Ganoderma lucidum[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(12): 1359-1370.

[29] Wagner R, Mitchell DA, Sassaki GL, et al. Links between morphology and physiology of Ganoderma lucidum in submerged culture for the production of exopolysaccharide[J]. Journal of Biotechnology, 2004, 114(1-2): 153-164.

[30] Papinutti L. Effects of nutrients, pH and water potential on exopolysaccharides production by a fungal strain belonging to Ganoderma lucidum complex[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(6): 1941-1946.

[31] Berovič M, Habijanič J, Zore I, et al. Submerged cultivation of Ganoderma lucidum biomass and immunostimulatory effects of fungal polysaccharides[J]. Journal of Biotechnology, 2003, 103(1): 77-86.

[32] Lee WY, Park Y, Ahn JW, et al. Factors influencing the production of endopolysaccharide and exopolysaccharide from Ganoderma applanatum[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(2): 249-254.

[33] Upadhyay M, Shrivastava B, Jain A, et al. Production of ganoderic acid by Ganoderma lucidum RCKB-2010 and its therapeutic potential. Annals of Microbiology, 2014, 64(2): 839-846.

 

 

 

声明：知料网发布的学术文章均由供稿单位提供，仅供行业交流，不代表本网观点，如有数据或宣传有关问题，请联系本网运营官（邮箱：403175523@qq.com）