NMN和NR作为NAD+前体在疾病和健康中的应用

 

NAD+/NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)是生物体内非常重要的辅因子，生物体内众多的氧化还原反应均需要NAD/NADH的参与。此外NAD+/NADH还参与呼吸链中，最终产生ATP。除了参与上述氧化还原反应和电子传递链以外，科学家还发现NAD作为一些酶的底物或共底物参与了一些非常重要的调节活动，这些酶包括聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP），环腺苷酸核糖cADPR合成酶和去乙酰化酶Sirtuin家族等。PARP是人体一种重要的酶，参与染色质松弛、信号转录、DNA修复和细胞凋亡等生理过程^[1]。cADPR合成酶可调节体内Ca2+平衡，从而可影响多个Ca2+依赖的活性，如细胞增殖、肌肉收缩、免疫反应及葡萄糖刺激的胰岛素分泌，体内最主要的cADPR合成酶为CD38^[2]。Sirtuin家族则是重要的长寿和新陈代谢的调控因子，哺乳动物的Sirtuin可参与p53，Foxo，PGC-1α、NF-κB、Ku70等蛋白相互作用，调控细胞应激反应、代谢、衰老和凋亡等过程^[3]。这几种酶都依赖消耗NAD才能在人体中正常工作，细胞内NAD+的减少会直接反应在这些蛋白的功能上，并引起人体机能的变化。

 

NAD+在人体内的合成主要有以下三个途径^[4]如图1所示：

 

1、从头合成途径：以色氨酸为起始原料，经过多步酶催化生成中间体奎宁酸QA，然后在奎宁酸磷酸核糖转移酶QPRT的作用下生成烟酸单核苷酸NAMN，再通过中间体烟酸腺嘌呤二核苷酸NAAD，最终生成NAD+；

 

2、Preiss–Handler途径：烟酸NA通过烟酸磷酸核糖转移酶NAPRT转化为NAMN，进入从头合成途径；

 

3、补救途径：烟酰胺核苷NR通过NR激酶NRK生成烟酰胺单核苷酸NMN，或烟酰胺NAM通过烟酰胺磷酸核糖转移酶生成NMN，NMN再通过NMN腺苷转移酶NMNAT生成NAD+。由于从头合成步骤多，体内主要通过补救途径合成NAD+。由于直接补充NAD+吸收差，且可能存在失眠、疲劳和焦虑等副作用，因此为了补充体内的NAD+，一般选择补充NMN，NR，NA和NAM。尤其是NMN和NR作为NAD+增强剂显示了更好的药物活性。

 

 

NAD+的耗竭是衰老和大量年龄相关疾病的标志，如各种神经肌肉疾病、心脏代谢疾病、肝脏疾病和肾脏疾病。因此，NAD+增强剂（NR和NMN等增加NAD+水平的化合物）的治疗和预防潜力已经在个中临床前疾病模型中进行了广泛的研究，这些研究均显示了NAD+增强剂较好的医用前景，从而后续开展了一系列的临床试验。针对不同的动物模型，其临床前研究分以下几个系统进行介绍：

 

大脑和神经系统

 

神经退行性疾病的最大特征就是蛋白质的错误折叠和大量积累，因为这可以引起严重的蛋白毒性应激反应，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）和朊病毒病，而这些疾病都与NAD+的耗尽和NAD+体内失衡有关。研究表明，线粒体功能在许多疾病中会严重受损，而通过NMN和NR等NAD+增强剂提高细胞内NAD +的水平可以有效恢复线粒体功能并改善疾病症状^[5,6]。NMN可以治疗AD的潜在病因，如线粒体的形态异常、耗氧率OCR和NAD+水平的降低。衰老和AD会造成NAD+水平的降低，从而导致大脑和肌肉细胞线粒体的OCR下降。而线粒体动力学完全依赖于线粒体的分裂和融合，因此线粒体趋向于更多的分裂，最终导致线粒体的形态和功能的异常。在AD-Tg小鼠模型中，NMN给药可以有效穿越血脑屏障，补充NAD+，并提高线粒体OCR。NMN还可以通过激活SIRT1从而刺激转录因子PGC-1α脱乙酰化，从而激活一系列线粒体生物合成相关基因的表达。在CaMK2a-mito/eYFP小鼠中，NMN处理还可以使线粒体碎片减少以及长度增加，从而保证了线粒体的完整性^[7]。除了上述恢复或维持线粒体功能外，NMN还可以降低β淀粉样蛋白的产生并降低β淀粉样斑块的负担^[8]，缓解淀粉样β低聚物诱导的海马长时程增强LTP抑制。在海马组织切片培养物中，NMN使淀粉样β低聚物诱导的细胞死亡并改善认知功能^[9]。

 

肌萎缩性侧索硬化（ALS）是由脊髓、脑干和运动皮层的运动神经元逐渐变性引起的。20%的家族性ALS和1-2%的偶发性ALS和超氧化物歧化酶SOD1突变有关。从过量表达人突变的SOD1的小鼠中分离的星形胶质细胞会诱导与其共培养的运动神经元死亡。补充NMN或NR则可以增加ALS星形胶质细胞中总NAD+的含量，并消除其对运动神经元的毒性。这种保护作用依赖于SIRT的表达。如前所述，SIRT在包括氧化应激抵抗等多种功能中发挥关键作用，在多种细胞类型和疾病模型中，增加NAD+可有效调节SIRT活性，从而增加氧化应激的抵抗力，降低线粒体活性氧的产生，这种保护至少在一定层度上取决于线粒体中抗氧化蛋白的激活，进一步研究发现通过补充NMN或NR增加NAD+的含量会激活核转录因子Nfe2l2或Nrf2，并上调抗氧化蛋白血红素加氧酶1（HO-1）和硫氧还蛋白1（SRXN1）^[10]。

 

轴突变性，又称华勒氏变性。在许多神经系统疾病中，这是引起神经元死亡的早期标志。研究表明，在AD、PD、ALS、缺血性脑和脊髓损伤、糖尿病引起的神经性病变、外伤性脑损伤等疾病中都会出现华勒氏变性。早在1900年，科学家们就发现NAD +和华勒氏变性之间存在联系。当时在一个偶然的机会，人们在小鼠身上发现了一种来源于自身的显性突变—华勒氏变性迟缓基因。该突变在很大程度上延迟了神经损伤后的华勒氏变性。在野生型小鼠中，人们检测到受损的轴突中会发生华勒氏变性，并且轴突的NAD +水平会显著下降（由SARM1引起）。而在含有华勒氏变性迟缓基因的小鼠中则未发现此情况，NAD+的水平会维持在一定水平并起到了保护轴突的作用^[11]随后，科学家进行了大量的实验，发现维持NAD +池的水平可以有效阻止轴突退化和缓解多种周围神经病变以及缺血性脑或脊髓损伤相关的轴突损伤 ^[12]此外，科学家还发现重新恢复NAD +的水平可以有效提高神经干细胞的增殖和再生能力，从而将在改善神经系统疾病中发挥至关重要的作用^[13]。

 

脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)是另一种神经系统疾病，约10-15%的中风是由脑出血造成的。脑出血引起的损伤分为两个阶段：首先，血肿形成对邻近组织造成机械性损伤，然后由血肿引起的病理改变（如细胞毒性、兴奋性毒性、激活引起神经炎症的炎症途径）引起继发性损伤。胶原酶诱导的ICH小鼠模型研究表明，脑出血30分钟后腹腔注射NMN可提高脑内NAD+浓度，对肌萎缩侧索硬化和缺血性卒中有保护作用。此外，NMN治疗还可改善脑水肿、神经元死亡、氧化应激、神经炎症，并降低细胞间粘附分子-1的表达，以及减少中性粒细胞浸润和小神经胶质细胞活化。这些均表明NMN可用于治疗ICH^[14]。

 

心血管系统

 

心脏NAD+水平的降低会伴随着不同的心脏病变。如冠状动脉疾病和心肌梗塞等情况下的心脏局部缺血。在心脏局部缺血会导致心肌细胞中的氧含量和ATP水平的下降，进一步恶化时，这些心肌细胞还会发生坏死，采用补充NMN或NR来恢复心脏的NAD+水平取得了较好的结果^[15,16]。再灌注，也被称为再氧化过程，是指给那些缺血的组织重新注入血液。再灌注导致血液重新进入组织，进而导致微血管损伤造成的钙离子过载以及产生活性氧，这些最终都会造成组织损伤。这种缺血及后续的再灌注是一种致命的情况，但会被人体的缺血预适应（IPC）机制缓解。IPC会诱导去乙酰化酶SIRT1的活化，SIRT1会使负责产生氧自由基的FoxO转录因子去乙酰化，从而提供了一种中和机制用于保护机体免于氧化压力和缺血再灌注造成的损伤。如前所述，SIRT1的去乙酰化活性依赖于胞内NAD+。Yamamoto等在杂合的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体（Nampt +/-）小鼠中开展研究，结果发现在局部缺血之前30min或在再灌注过程中每6h（共24h）腹腔注射NMN 500mg/kg，能显著的改善缺血再灌注损伤，分别降低梗死面积44%和29%^[17]。此外，在局部缺血和再灌注之前或过程中补充NMN还可以通过刺激糖酵解或酸中毒从而起到心脏保护作用^[18]

 

不同类型的心肌疾病中NAD+平衡的紊乱非常普遍。服用NMN和NR可降低心力衰竭风险^[15,16]。心力衰竭与线粒体功能障碍密切相关，补充NMN可有效的防止心力衰竭。经研究发现，补充NMN可保护线粒体的超微结构，降低氧化应激，防止心脏细胞的死亡^[15]。与人的假肥大型肌营养不良症(DMD)类似，随着年龄的增长，mdx小鼠易发展为心肌病。通过服用NR维持心脏的NAD+水平可改善心脏功能。心脏肥大是另一种伴随着NAD+水平下降的疾病，通过服用NMN恢复NAD+水平可防止线粒体复合体I缺陷的小鼠模型中因压力负荷造成的心脏肥大^[19]。这些研究均表明通过补充NMN或NR来维持NAD +稳态以保护心脏功能的重要性。

 

动脉粥样硬化与内皮功能障碍、巨噬细胞的聚集和血管壁细胞中平滑肌的退化有关。SIRT1的活化对所有的这些细胞类型都有保护作用，并且还具有动脉粥样硬化保护作用。在衰老小鼠模型中，可以观察到血管内皮依耐性舒张功能受损，服用NMN可增加NAD+及超氧化物歧化酶SOD水平，增加血管SIRT1活性，从而逆转年龄相关的血管功能障碍和氧化压力^[20]。在动脉粥样硬化的早期阶段，巨噬细胞通过摄取修饰的血浆LDL胆固醇变成泡沫细胞，从而促进了动脉粥样硬化斑块的形成。据报道，沉默NAMPT（NAMPT催化NAM合成NMN，是NAD+补救途径中的关键酶之一）基因或添加其抑制剂均会刺激巨噬细胞中脂质的积累，NAMPT的调节与动脉粥样硬化的形成密切相关^[21]，但补充NMN或NR等增加NAD+水平是否会换件动脉硬化斑块的形成还有待于进一步研究。

 

内皮细胞中NAD +的增强也可以恢复其血管生成能力。在脂质或葡萄糖过量的情况下，服用NMN或增强NAMPT活性可以改善内皮细胞的血管生成功能^[22]。而且，对于衰老小鼠，NMN给药可恢复肌肉中的毛细血管密度，从而改善跑步机能，并通过增加内皮血管舒张来挽救受损的神经血管耦合^[23]。

 

造血系统

 

造血干细胞(HSCs)在造血过程中可以产生十多种不同类型的成熟血细胞来维持血液系统的运作。身体受到损伤后，造血干细胞能够迅速增殖，产生多功能祖代细胞，并通过细胞分化来补充各类衰亡的细胞种群。为了维持这种功能，有一部分干细胞必须保持其自我复制与再生的能力。这部分造血干细胞喜欢缺氧的环境，其线粒体潜能较低，主要依靠糖酵解产生能量。较低的线粒体活性是造血干细胞自我复制与再生的功能特征。NR和NMN可以通过降低线粒体活性和增加线粒体自噬来清除线粒体，促进体内造血细胞的生成，以此来提高小鼠造血干细胞移植后的存活率^[24]。这与NR和NMN在其他类型细胞中增强线粒体活性以及促进线粒体生物发生的功能完全相反。具体机制还有待于进一步研究。

 

出血性休克是由于血液的大量流失引起的，这会导致血管收缩和组织低压灌注，并最终使身体组织缺氧死亡。如果没有适当的临床处理，出血性休克会导致多器官衰竭，特别是肝脏和肾脏。尽管血液循环的急剧减少一直被认为是出血性休克最主要的病理学因素，但动物和人类的出血性休克都无一例外出现了造血功能衰竭，揭示了这或许也是引起疾病的重要组成部分。由于NR和NMN对造血功能有较好的作用，所以科学家进一步研究发现使用NMN可以有效防止出血性休克引起的器官代谢紊乱^[25]。NMN给药的另一个好处是降低血液循环中促炎细胞因子IL-6的水平^[25]，而IL-6是出血性休克严重程度的标志物。科学家在巨噬细胞中也观察到NAD +相关的抗炎作用。NAD +的从头合成通路对于维持巨噬细胞中NAD +的水平是至关重要^[26]。一项关于巨噬细胞的研究报道了NAMPT在炎症反应下(如脂多糖LPS刺激后)会增加表达，而NAMPT是NAD+补救合成途径中的限速酶,会限制NAD+的再生。还有研究检测到了巨噬细胞在脂多糖刺激后PARP的过度活化，这可能也是导致NAD +耗尽的原因^[26]。此外，LPS刺激还会导致巨噬细胞中CD38的表达增加。综上所述NAD+的耗尽或者生成NAD+体内合成通路受到干扰都会影响体内造血系统和免疫系统的运作。补充NAD+可以有效维护造血系统的运作和增强体内免疫系统的抗炎效果。

 

除了上述系统外，许多肝脏、肾脏和肌肉相关疾病也都和NAD+的耗尽以及线粒体功能的损伤相关，通过补充NMN或NR可以恢复NAD+水平以及线粒体功能并促进一系列有益效果，从而表现出非常好的临床前治疗效果。 ^{[27,28,29,30,31]}。此外，NAD+增强剂还具备多种功能，如NMN被发现有助孕的功能^[32]，NMN还可以有效地减轻小鼠年龄相关的生理衰退^[33]，可以看作人类有效抗衰老潜在药物。NMN和NR均取得了类似的较好的临床前疗效，但也存在NR没有疗效而NMN治疗成功的案例，如弗里德希氏共济失调^[8,34]。此外，NMN可以抑制淀粉样淀粉样前体蛋白APP以及刺激非淀粉样前体蛋白前体，从而降低β淀粉样蛋白的产生并降低β淀粉样斑块的负担，而NR则没有上述效果^[8,34]。由于其临床前的诸多有益功能，业内目前有超过30个NR/NMN的临床研究正在进行或正在招募参与者。2019年2月19日，日本Shinkowa（新兴和）制药有限公司发布了“长期（24周）口服NMN对人体的影响”的临床试验中期报告，首次临床证实：人体口服NMN后长寿蛋白表达增加，并且多种类型激素表达也都有增加。随着研究的日益广泛和深入，相信NMN和NR等NAD+前体将在疾病治疗和健康领域发挥越来越重要的作用。

 

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