双歧杆菌V9的由来与应用研究

 

摘要：双歧杆菌作为评价人体肠道的健康与否的重要标志物，在人类的长期进化中与宿主形成互惠共生的关系。作为人体肠道的一种重要益生菌，双歧杆菌通过定植于机体肠道黏膜细胞，参与机体免疫、营养、消化和保护等一系列生理过程，起到提高免疫力、调节肠道菌群 结构、促进营养成分吸收等作用，本菌株研究人员采用体外实验、动物模型和临床试验对B.animalis V9 的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学的手段对B.animalis V9的益生机制进行了深入剖析。完成了益生乳酸菌B.animalisV9高密度发酵的中试生产和工业化生产，利用B.animalisV9开发益生菌制剂产品，包括益生菌菌粉原料、益生菌制剂、益生菌片剂、胶囊剂等系列产品工业化生产。

 

关键词：双歧杆菌V9；分离鉴定；益生功能

 

双歧杆菌( Bifidobacterium)是自然栖居在人体肠道中的有益菌株。在微生态学上属于原籍菌群( autochthonous flora)人类出生后几个小时，双歧杆菌在肠道内开始出现，到1-2周便形成绝对优势。母乳营养儿肠道菌群中该菌占99％以上，人工营养儿占90％以上，并且双歧杆菌终生存在于人体肠道中，只在生病或衰老时减少。在成人肠道中约占到肠道总菌数的 3 %～10 %, 而在婴儿肠道中这一比例超过 91 %^[1] , 双歧杆菌在肠道内的数量是评价机体健康程度的重要指标^{[ 2]} , 其主要作用在于可抑制有害菌群 、维持肠道菌群平衡、保护肠粘膜屏障 、代谢产生有机酸、促进肠道蠕动、腹泻便秘双重调节^[3]。由于长期的进化过程中微生物与宿主形成特殊的共生关系, 使得大多数生物都具有宿主特异性 , 双歧杆菌也不例外。来源于人体自身的双歧杆菌 , 更有利于其在人体肠道中定植。 

 

1.双歧杆菌V9菌种的筛选与基础研究

 

动物双歧杆菌 (Bifidobacterium animalis subsp.LacticV9)是 1 株具有益生特性的优良菌株(图1),是内蒙古自治区乳品科学研究所八十年代初分离自健康蒙古族儿童肠道。同时筛选菌株十余株，与金双歧中添加的长双歧杆菌为同源菌，菌株由当时的中国医科院鉴定，双歧杆菌细胞形态一端有时呈分叉状，细胞单个或排列成V形，分离筛选标号为第九号株，所以命名为“V9”，B.animalis V9。并保存于内蒙古轻工科学研究所的菌种库中（保藏乳酸菌1900余株），之后陆续进行十余年对双歧杆菌的研究开发工作，解决技术关键-菌种的筛选培养，活菌数的提高，制品保存期的存活率等。对双歧杆菌V9益生功能评价研究开始于2008年内蒙古普泽生物公司成立，普泽生物联合内蒙古农业大学通过产学研结合进行深入研究，研究人员采用体外实验、动物模型和临床试验对B.animalis V9 的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学的手段对B.animalis V9的益生机制进行了深入剖析。经过多年系统的基础研究，自主解决了其产业化的关键技术问题，包括直投式发酵剂、发酵豆乳益生菌饮料、发酵乳制品、益生菌奶粉、益生菌固体饮料、益生菌片剂和益生菌胶囊等产品，并实现了产业化。

 

 

1.1益生特性双歧杆菌的筛选

 

pH 值的高酸性环境以及其内存在的消化酶，酸性环境会降低质子动力，破坏双歧杆菌细胞内外的渗透压平衡^[4]；然后是小肠内高浓度的胆盐和内源性的抗菌肽还有肠道固有菌群对机体的防御系统，甘氨胆酸盐和牛黄胆盐具有细胞膜毒性，胆盐水解酶活性高的双歧杆菌将胆盐水解成次级胆盐能够降低其细胞膜毒性；双歧杆菌粘附到肠道上皮细胞的能力大小以及能否利用不被宿主消化代谢的营养物质（某些蛋白质类物质、低聚糖等益生元等）都会影响双歧杆菌的肠道定殖。通常情况下，人体肠道菌群组成会维持一个相对平衡的状态，Bennet 等^[5]认为人体肠道内的固有菌群对肠道内环境具有很强的适应性，外源性的双歧杆菌不大可能性能更优越以致替换掉肠道中原有的微生物而永久地存活下来，也就是说双歧杆菌为肠道原籍菌，能长期定殖于肠道。所以，理论上讲，为了应对由胃肠道环境产生的巨大影响^[6]，双歧杆菌自身必须具备相对应的耐受机制^[7-20]，才可能具有在肠道内定殖的能力。B.animalisV9在pH2.0的人工胃液中厌氧培养3h后存活率为92.4%;B.animalisV9在pH2.0的人工胃液中厌氧培养3h后接入pH8.0的人工肠液中消化8h，存活率为99.7%，并且可以耐受0.3%的牛胆盐^[21]。实验结果见图2。 

 

1.2 B .animalis V9 16S rDNA 鉴定结果

 

采用分子生物学手段 16S rDNA 对 Bifidobacterium animalis V9 进行鉴定，通过 PCR 产物直接测序，获得长度为 1,433bp 的 16S rDNA 序列。通过 NCBI BLAST 比对分析，发现与 Bifidobacterium animalis subsp. lactis 模式菌株 Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM10140 和益生菌株 Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB12 的同源性为 99%。运用专业软件 Mege 4.0 构建 Bifidobacterium 属内 31 个种 以及 Bifidobacterium animalis V9 的系统发育树，如图 3 所示。 

 

图 3 Bifidobacterium 属 16S rDNA 系统发育树

 

1.3 Bifidobacterium animalis V9基因组学研究^[22]

 

2009年，采用全基因组鸟枪法测定了Bifidobacterium animalis V9全基因组序列并进行了功能基因组学分析（GenBank登录号：CP0018 92），见图4。结果表明：Bifidobacterium animalis V9 染色体基因组为环状分子，平均G+C 含量为60.5%，染色体的长度为1,944,050 bp，分析得到了1,636 个开放可读框（ORF），其中1,572 个编码区（CDSs）可以被 赋予潜在的生物学功能。

 

图 4 B. animalis V9 全基因组图谱

 

2.Bifidobacterium animalis V9的益生功能评价

 

2.1 B. animalis V9对肠道致病菌的拮抗作用

 

将B.animalis V9分别与肠道致病菌（志贺氏痢疾杆菌 Shigella Shigae、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella Typhimurium、大肠埃希氏菌Escherichia Coli、铜绿假单胞菌Pseudomonas Aeruginosa）在TPY 培养基中37 ℃两两混合培养，定时取样计数。B.animalis V9 与4种肠道致病菌两两共同培养60h后，供试肠道致病菌均未检出，而 B. animalis V9活菌数量仍未明显降低（P<0.05），实验数据 见图3。这一研究结果表明，B. animalis V9对肠道致病菌具 有显著的拮抗作用（P<0.05）。

 

 

图5 B.animalis V9 可有效抑制肠道致病菌生长繁殖

 

2.2 B . animalis V9对腹泻动物的保护性作用及其机制研究

 

以抗生素性腹泻小鼠为模型，用Bifidobacterium animalis V9喂食小鼠3d（低剂量组（L） ：2.0×10⁷ CFU/d、中剂量组（M） ：4.0×10⁷ CFU/d、高剂量组（H）：1.0×10⁸CFU/d）。结果显示：随图6 B. animalis V9 可有效抑制肠道致病菌生长繁殖animalis V9喂食剂量的增加，小鼠粪便和盲肠内容物中肠杆菌活菌数均显著减少（P<0.01），类杆菌、乳杆菌和双歧杆菌数量均显著增加（P<0.01），实验数据见图9；B. animalis V9可显著提高腹泻康 复率（P<0.01），同时显著降低腹泻死亡率（P<0.01）， 可以有效治疗腹泻，实验数据见图7。

 

 

 

2.3 B.animalisV9抗生素敏感性试验 ^[23]

 

动物双歧杆菌 V9(B.animalisV9)菌株进行抗生素敏感性测试。菌株对针对 G+菌的抗生素, 如青霉素类(青霉素 G、氨苄青霉素)和大环内酯类 (氯霉素、红霉素)表现出高度敏感;对抑制细菌蛋白质合成的广谱(G+、G-)抗生素(四环素、利福平、痢特灵)表现 出中度敏感;对 G-菌的抗生素, 如氨基糖苷类(庆大霉素、链霉素)、喹诺酮类 (诺氟沙星)及内酰胺类 (卡那霉素、丁胺卡那霉素)表现出耐药性;而对广谱抗生素磺胺甲基异噁唑也表现为耐药。

表 1 B.animalisV9敏感类抗生素抑菌情况(mm)

 

 

2.3.双歧杆菌 V9 对便秘和腹泻患者的临床研究^[24]

 

以B. animalis V9为研究对象，对153例患有便秘或急慢性腹泻患者进行21d的临床治疗（1.0× 10¹⁰CFU/d）。治疗期间，每3 天记录一次受试患者的排便频率和粪便形态，并在试验前和试验后采 集粪便，测定受试患者体内主要肠道菌群的变化情况。试验结果表明，B. animalis V9可有效治疗便秘、急性腹泻和慢性腹泻，临床治疗有效率分别为95.3%、95.4%和89.9%，实验结果见图8。

               

 

与试验前相比，患者粪便中双歧杆菌数量显著增加（P< 0.01）， 肠杆菌、肠球菌、拟杆菌和产气荚膜杆菌的数量也发生了显著的变化 （P< 0.01），更加趋向于健康人群的肠道菌群结构，实验结果见图12，试验结果表明：B. animalis V9可以使人体肠道菌群结构健康化。

 

表3  B. animalis V9 可以有效调节便秘和腹泻患者的肠道菌群，使人体肠道菌群健康化

 

3.双歧杆菌V9菌粉工业化生产

 

通过代谢调控的手段，完成了益生乳酸菌B.animalisV9高密度发酵的中试生产和工业化生产。冷冻干燥可得到平均活菌数大于1×10¹¹cfu/g的菌粉见下图9，能够满足益生菌制剂和发酵剂对高活菌数的要求。利用B.animalisV9开发益生菌制剂产品，包括益生菌菌粉原料、益生菌制剂、益生菌片剂、胶囊剂等系列产品工业化生产。同时对益生菌B. animalis V9冻干菌粉进行安全性毒理学评价，确保该菌株在发酵乳制品及保健类食品中的应用安全。通过急性毒性试验及相关指标检测结果显示B. animalis V9菌粉无毒副作用^[25]。双歧杆菌作为评价人体肠道的健康与否的重要标志物，在人类的长期进化中与宿主形成互惠共生的关系^[26]。

 

4.小结

 

采用体外实验、动物模型和临床试验对B.animalis V9的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学的手段对B. animalis V9的益生机制进行了深入剖析。经过多年系统的基础研究，试验证明该菌具有良好的耐酸、耐胆盐特性，活性高，具有调节肠道菌群平衡、拮抗体内致病菌、防止腹泻、增强免疫的功能。双歧杆菌不仅具有营养功能如产生维生素，同时还具有抗感染、抗癌作用； 双歧杆菌通过促进肠道黏膜 SIgA 系统的成熟等机制促进免疫系统的发育和成熟 ^[27]。因此，双歧杆菌的正常发育，即在合适的时间定植合适的双歧杆菌，对人体的健康成长有着重要的意义。

 

参考文献：

[ 1 ] M .Carmen Collado , Yolanda Sanz .Method for direct selection of potentially probiotic Bifidobacterium strains from human feces based on their acid-adaptation ability .Journal of Microbiological Methods, 2006, 6(7):560-563.

[ 2 ] Apostolou E , Pelto L.Differences in the gut bacterial flora of healthy and milk-hypersensitive adults, as easured by fluorescence in situ hybridization .FEMS Immunology and Medical Microbiology , 2001, 30:217-221.

[ 3] 金红芝, 范小兵, 杭晓敏, 等.儿童肠道双歧杆菌和乳 杆菌种群结构分析.微生物学报(Acta icrobiologica

Sinica), 2005 , 45(4):567-570.

[4]韩俊燕,张灏,赵国忠. 双歧杆菌生理特性与其肠道定殖能力相关性的研究.[D]无锡: 江 南 大 学,2016

[5] Bennet  R，Nord  C，Zetterström  R.  Transient  colonization  of  the  gut  of  newborn  infants  by  orally administered bifidobacteria and lactobacilli [J]. Acta Paediatrica，1992，81(10): 784-787.

[6] González-Rodríguez I，Ruiz L，Gueimonde M，et al. Factors involved in the colonization and survival of bifidobacteria in the gastrointestinal tract [J]. FEMS microbiology letters，2013，340(1): 1-10.

[7] Mitsuharu M，Hifumi O，Yoshimi B. H+-ATPase activity in Bifidobacterium with special reference to acid tolerance [J]. International Journal of Food Microbiology，2004，93(1): 109-113.

[8] Wang L-Q，Meng X-C，Zhang B-R，et al. Influence of cell surface properties on adhesion ability of bifidobacteria [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26(11): 1999-2007.

[9] Noriega  L，Cuevas  I，Margolles  A，et  al.  Deconjugation  and  bile  salts  hydrolase  activity  by

Bifidobacterium strains  with  acquired  resistance  to  bile  [J].  International  Dairy  Journal，2006，16(8): 850-855.

[10] Masuda  K，Sakai  N，Nakamura  K，et  al.  Bactericidal  activity  of  mouse  α-defensin  cryptdin-4 predominantly affects noncommensal bacteria [J]. Journal of innate immunity，2010，3(3): 315-326.

[11] Kabeerdoss J，Devi R S，Mary R R，et al. Effect of yoghurt containing Bifidobacterium lactis Bb12 on faecal excretion of secretory immunoglobulin A and human beta-defensin 2 in healthy adult volunteers [J]. Nutrition journal，2011，10(1): 1-4.

[12] Schell M A，Karmirantzou M，Snel B，et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its adaptation to the human gastrointestinal tract [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2002，99(22): 14422-14427.

[13] Christiaen  S  E，Motherway  M  O  C，Bottacini  F，et  al.  Autoinducer-2  plays  a  crucial  role  in  gut colonization  and  probiotic  functionality  of  Bifidobacterium  breve UCC2003  [J].  Plos One，2014，9(5): e98111-e98111.

[14] González-Rodríguez  I ， Sánchez  B ， Ruiz  L ， et  al.  Role  of  extracellular  transaldolase  from Bifidobacterium bifidum in mucin adhesion and aggregation [J]. Applied and environmental microbiology，2012，78(11): 3992-3998.

[15] Gilad O，Jacobsen S，Stuer-Lauridsen B，et al. Combined transcriptome and proteome analysis of Bifidobacterium  animalis subsp.  lactis BB-12  grown  on  xylo-oligosaccharides  and  a  model  of  their utilization [J]. Applied and environmental microbiology，2010，76(21): 7285-7291.

[16] Lagaert S，Pollet A，Delcour J A，et al. Characterization of two β-xylosidases from Bifidobacterium adolescentis and  their  contribution  to  the  hydrolysis  of  prebiotic  xylooligosaccharides  [J].  Applied microbiology and biotechnology，2011，92(6): 1179-1185.

[17] Janer  C ， Rohr  L  M ， Peláez  C ， et  al.  Hydrolysis  of  oligofructoses  by  the  recombinant β-fructofuranosidase from Bifidobacterium lactis [J]. Systematic and applied microbiology，2004，27(3): 279-285.

[18] Pokusaeva K，Fitzgerald G F，Sinderen D V. Carbohydrate metabolism in Bifidobacteria [J]. Genes & Nutrition 2011，6(3): 285-306.

[19] Goulas  T，Goulas  A，Tzortzis  G，et al. Expression of four β-galactosidases  from  Bifidobacterium bifidum NCIMB41171 and their contribution on the hydrolysis and synthesis of galactooligosaccharides [J]. Applied microbiology and biotechnology，2009，84(5): 899-907.

[20] Sela  D  A，Mills  D  A.  Nursing  our  microbiota:  molecular  linkages  between  bifidobacteria  and  milk oligosaccharides [J]. Trends in microbiology，2010，18(7): 298-307.

[21 ]高鹏飞,孙志宏,麻士卫,等. 蒙古族儿童源益生特性双歧杆菌的筛选及鉴定[J]. 微生物学报,2009,49：210－216.

[22] 高鹏飞, 孙志宏, 麻士卫, 等.B.animalisV9对腹泻动物的保护性 作用及其机理研究[ J] .中国微生态学杂志, 2009, 21(9):385-387

[23] 麻士卫 ,陈霞 ,高鹏飞 ,等B.animalisV9质粒检测及抗生素敏感性试验 [ J]中国微生态学杂志 2009，21(9):792-795

[24]王记成, 高鹏飞, 周琦, 王秋实, 赵虎云, 张和平. 双歧杆菌 V9 对便秘和腹泻患者的临床研究. 营养学报, 2011, 1:76-80.

[25]梁春梅,,高鹏飞,陈震,王记成.益生菌 B . animalis V9冻干粉安全性毒理学研究.[ J]中国微生态学杂志 2010,22(6):481-488 

[26]Sarkar A， Mandal S. Bifidobacteria -Insight into clinical outcomes and mechanisms of its probiotic action [J] . Mi－ crobiological Research，2016 （5）：159-171.

[27] 王少博，陈树兴，程晶晶，百岁老人肠道双歧杆菌分离鉴定研究[J] . 农产品加工2020（5）：56-58.

 

 

 

声明：知料网发布的学术文章均由供稿单位提供，仅供行业交流，不代表本网观点，如有数据或宣传有关问题，请联系本网运营官（邮箱：403175523@qq.com）